Abstract 摘要

当拉伸时，在2D基底上培养的细胞分享精深的软化和流化反应，这是由于对保守的细胞骨架元件的重塑知之甚少。然则，无人不晓，细胞骨架的结构和漫步受到细胞环境维度的真切影响。因此，在这项讨论中，咱们的主张是细目在3D基质中培养的细胞是否具有这种软化行径，并将其与细胞骨架重塑规划起来。为了好意思满这一方针，咱们开导了一种高通量的门径来测量细胞的动态力学特色，并允许在生理规划的3D微组织内进行亚细胞成像。咱们发现，成纤维细胞，平滑肌和骨骼肌微组织应变软化，但不变形，并在加载住手后，他们规复其启动的机械性能。此外，微组织预应力跟着应变幅值的减小而减小，以保合手恒定的平均张力。 这种妥当下的养分条目下导致延长。一个丝状的肌动卵白细胞骨架是必需的，并反应了反应的变化，肌动卵白重塑率和拉伸疏导的肌动卵白解聚的视觉凭证。咱们用于评估细胞力学的新门径将2D培养物中不雅察到的行径与3D基质规划起来，并将细胞骨架的重塑与组织的稳态机械调遣规划起来。

Introduction 先容伸开剩余96%

跟着每一次呼吸，心跳和洞开，咱们躯壳中的细胞资格周期性的机械拉伸，这反过来又在粘着灶处产生合手续不踏实的力，穿过细胞膜，沿着细胞骨架丝并穿过细胞核1，2。在细胞中，这些力通过产生构象变化来提醒功能和表型行径，从而编削配体-受体亲和力1，2。紧迫的是，细胞感受和妥当机械力的才能与正常发育和功能以及疾病进展（包括骨骼、肌肉、腹黑和肺部疾病以及癌症）中的重要事件规划3，4。

突出是，构成真核细胞细胞骨架的保守结构元件自己是机械明锐的;响应动态拉伸，细胞骨架软化（弹性裁汰），变得更像流体（增多相位滞后/弹性）5，6，7，8。然后，在伸展住手时，它会缓缓规复僵硬并从头凝固7。由于这种反应背后的分子机制（S）仍然不明晰，量化细胞骨架重塑后，周期性拉伸的视觉凭证口角常紧迫的，咱们的领域9，10，11，12，13。 此外，尽管在亚细胞水平5、6和单细胞水平7、8不雅察到响应于变形的软化和流化，但是在组织水平14、15、16对响应的进程仍然知之甚少。然则，在躯壳中，该响应与气说念口径14、15的保管和血压17的调遣规划联。然则，由于未知的原因，它在某些病感性疾病中不存在。举例，与健康的肺不同，深吸气的伸展不会延伸哮喘息说念18。

咱们咫尺对这种应变软化行径的意会主要来自于对离体组织样品和分离细胞的讨论。固然讨论齐备的体外样品的机械行径照旧进一步加深了咱们对拉伸的组织水平响应的意识14、15、16、19，但是这种门径对于进展亚细胞重塑具有较差的分辨率。离体组织的使用可能进一步受到供体间变异性和样品可用性低的遏制。另一方面，亚细胞细胞骨架重塑反应和机械转导阶梯在很猛进程上是通过在刚性平坦名义上一身滋长细胞而发现的。然则，无人不晓，细胞滋长的物理环境会编削其机械特色和行径。 举例，滋长在刚性基底上的细胞倾向于使其肌动卵白细胞骨架陈设成紧密的应力纤维，而况当与较软基底20、21、22上的细胞比较时更刚性、更像固体而况处于更大的预应力下。

除了基质硬度，东说念主们怀疑细胞的力学行径可能会进一步编削其环境的维度。为了支合手这一不断增长的假定，在2D基质上培养细胞与在生理学上更规划的3D基质内培养细胞比较，通过迫使粘附复合物的非自然顶部-底部极性，从压根上编削了细胞骨架的漫步和结构23。刚性，平坦，培养皿和软3D细胞外基质（ECM）之间的互异也不错解释不雅察到的细胞行径互异，以及使用成例2D细胞培养期间开导药物解救时频繁发生的腾贵临床试验中的疗效亏空24，25，26，27。 因此，需要新的高通量细胞培养期间，其好像在细胞和亚细胞水平上探伤机械行径，同期保合手生理学规划的软3D环境。

为了缓和这一需求，允许评估重建的3D胶原凝胶内细胞的机械行径的期间一直是机械生物学、药理学和组织工程领域的浓厚敬爱28。突出是对于它们对拉伸的响应，已知3D培养物内的细胞通过在违背方朝上编削它们的收缩性来响应基质张力的准静态变化，以便在通盘细胞培养物中保合手张力稳态29、30。在其他出书物中，步长变化后的这些行径与肌动卵白解聚和随后的强化反应规划31，32。 然则，仍然不明晰3D培养物是否在齐备的离体组织样品和分离的细胞的轮回拉伸下具有一样的机械和细胞骨架重塑响应14、15。也即是说，在3D培养物的动态拉伸期间，照旧泄露随后的加载轮回的峰值力朝向平台33减小，这标明妥当性应变软化行径。然则，咱们的领域短缺一个齐备的表征，这种机械响应和细胞骨架重塑动态拉伸在3D细胞培养。

尽管3D细胞培养在生理学上更规划，第三维可能会显赫编削咱们对细胞力学的意会，但2D培养仍然是咱们领域的主导期间。在其原因中，在先前的讨论34、35、36中使用的实质凝胶的厘米规范截止了实验通量，导致成像清贫，产生育分物的高扩散障蔽，而况可能减缓对可溶性因子的动态响应。然则，批量3D细胞培养的这些局限性在很猛进程上不错通过禁受芯片实验室门径缩小细胞培养尺寸来克服。在这方面，Legant et al. s37.微制造的组织计量器（微组织）允许对细胞收缩期间的快速能源学和力产生进行相对高通量的评估37。 在他们的模子中，细胞在胶原卵白基质中，并在成对的柔性垂直杠杆周围酿成一系列紧密的、有组织的结构，与离体组织格外。高通量张力测量不错从杠杆的可见偏转筹备出来。最近，讨论东说念主员将磁性微球固定在每个微组织孔中的一个杠杆上，并使用磁性镊子一次拉伸一个微组织以进行准静态刚度测量38，39。磁驱动装配的实验通量和致动范围的截止最近由咱们的微组织微致动拉伸器（MVAS）40贬责。在这项职责中，由于大部分平面变形和慢性（几天）调遣后，MVAS不错高通量可视化拉伸期间的细胞重塑。

咱们咫尺建议了一种新的微组织拉伸器，MVAS力，它不错测量张力和动态力学分析。与咱们当年的盘算违背，MVAS-力中只消一个悬臂通过调遣真空压力驱动，而同期从另一个悬臂的被迫迤逦测量力。在这篇著作中，这种新的门径使咱们好像评估动态加载进程中庸加载住手后的微组织的机械性能，并说合到亚细胞重塑力学的变化，使用响应药物解救和平直成像的细胞骨架。从咱们对细胞感知机械力的才能或受损才能的门径中不错得回的发现可能对于了解体内发育，正常功能和疾病进展的阶梯至关紧迫。

Results 效果Microtissue morphology 微组织阵势学

在MVAS-Force中，3 T3成纤维细胞围绕杠杆自拼装成紧密、高度组织化的三维结构，在阵势上肖似于组织。完全压实的代表性微组织的俯瞰图和横截面图如图1c所示。如先前37、40、41所示，细胞将胶原基质从孔的底部和侧面压缩成解放悬浮在悬臂顶部周围的组织。4天后在其中心测量的平均微组织厚度为97 ± 2 μm（n = 5），而况沿纵轴沿着定性均匀。

MVAS-Force可对3D细胞培养物进行高通量动态力学测量。MVAS-力由三个微制造器（a）微制造。它包括微组织威尔斯阵列，每个微组织由可控真空室（B）界定。（c）中泄露了微组织的自顶向下和横截面视图。微组织是紧密的、有组织的、三维的细胞培养物，它们解放地悬浮在细胞杠杆周围。共焦叠层、正交视图和高放大率图像的最大投影示于（d）中。肌动卵白细胞骨架为绿色，细胞核为蓝色。细胞骨架和细胞核都泄清晰高度的组织化，在细胞杠杆之间陈设。B、c和d中的比例尺鉴识示意1 mm、100 μm和50 μm。

图1d泄露了一个典型的微组织在四天内的正交切片和中央位置的F-肌动卵白和细胞核的放大视图的最大强度投影。肌动卵白高度团员成紧密的应力纤维，这些应力纤维与微组织的纵向轴线取向。细胞核也大多与微组织对皆，而况在三维中均匀漫步。

Microtissues strain soften to maintain their mean tension微组织应变软化以保合手其平均张力

据平素报说念，急性动态拉伸编削了二维名义上滋长的细胞的机械性能;它们变得更柔嫩（弹性裁汰）和更像流体（相位滞后增多）7，11，42。在这方面，咱们脱手讨论是否由3 T3成纤维细胞构成的3D微组织分享这些行径，通过评估它们在0.25 Hz下缓缓增大的应变下的动态力学性能。

如所预期的，微组织储存刚度（k '）以应变依赖性相貌裁汰（N = 22，线性转头：R2= 0.97，p < 0.001）（图2a）。比较9%至1%应变，平均储存刚度裁汰26 ± 2%（重复测量t试验：p < 0.001）。然则，与先前发表的对于2D培养物7和齐备气说念肌肉组织条14、15中的细胞的发现不同，其中软化伴跟着更肖似流体的行径（或流化），微组织的相位滞后（δ）反而跟着应变幅度而裁汰（线性转头：R2= 0.95，p < 0.01）（图2b），标明在较高水平的应变下，对于给定量破钞的更精深的能量储存。 因此，与分离的细胞7和离体组织条14、15比较，成纤维细胞微组织跟着它们软化而变得更像弹性。

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3 T3成纤维细胞微组织应变软化以保合手恒定的平均应力。跟着回荡应变幅的增大（N = 22），储存刚度k '（a）、应力-应变相位滞后δ（B）和预应力T0（c）均减小。紧迫的是，尽管平均微组织长度L avg（d）线性增多，但刚度和预应力的裁汰导致平均应力Tavg（c）恒定。在养分滋长条目下，这些行径增多了偏移微组织长度L。为了不雅察这些反应是否可逆，微组织在大幅度应变下回荡，直到随后的加载轮回重迭（1），然后倏得切换到小幅度应变（2）（e）。 存储刚度（f）和预应力（g）在160秒内以相似的速度完全规复到其启动值（N = 8）。在该图中，预应力和平均应力示意为与最小应变幅的差。

微组织中的软化反应还伴跟着其预应力（To）的裁汰（线性转头：R2= 0.97，p < 0.001）（图2c）。比较9%应变与1%应变，平均预应力裁汰2.7 ± 0.3 μN（N = 22，重复测量t试验：p < 0.001）。紧迫的是，与软化响应一齐，预应力的这种裁汰导致平均张力相对于应变幅度不变（线性转头：p > 0.5）（图2c）。尽管平均微组织长度（Lavg）线性增多（线性转头：R2= 0.99，p < 0.001），但仍发生了这种行径（图2d），而况标明细胞和组织具有内在的张力稳态响应29，30。

此外，由于咱们琢磨了养分滋长条目，因此在加载轮回期间的最小微组织长度（L。偏移长度）随拉伸幅度增多（线性转头：R2= 0.99，p < 0.001）（图2d）。因此，与先前对于离体组织条15、19的报说念一致，微组织在动态拉伸下的张力调遣才能导致其延长。

上述应变软化响应在复返到小振幅回荡时是完全可逆的（图2e）。刚度和预应力规复鉴识如图2f、g所示（N = 8）。160秒后，微组织刚度规复到其启动值的99 ± 3%，而况预应力与启动测量值吻合难懂（两次重复测量t试验：P > 0.05）。刚度和预应力的规复弧线撤职拉伸指数函数（等式10）。1）具有一致的时候（τ）（38 ± 1对35 ± 6秒）和幂律常数（β）（0.87 ± 0.01对0.92 ± 0.08）（SI 1）。此外，偏移的微组织长度也以一样的能源学规复（数据未示出）。

为了细目在轮回加载进程中微组织内的软化行径若何发展，在图3中查验了从静态脱手的第一双调遣轮回。在0.25 Hz的加载频率下，微组织的机械行径在这些启动加载轮回中妥当（图3a）。在这方面，预应力朝着新的设定值下跌（图3c），而平均张力飞速增多，然后踏实回到静息张力（图3d）。当咱们琢磨到一个滋长张力负荷时，这些变化导致了渐进的组织延长（图3e）。违背，当加载时候（400秒）比规复时候常数（1/fτ）慢得多时，机械妥当的进程裁汰，而况主要发生在第一个加载轮回中（图3b-e）。 此外，当以这种沉稳的速度围绕偏移应变回荡时，平均张力并不踏实于其静息张力（图3d）。因此，只消当动态加载速度快于张力规复速度时，张力稳态才会发生。

对回荡负载的妥当取决于负载频率。在0.25 Hz和0.0025 Hz下，从静止脱手的平均（N = 6）调遣轮回鉴识如（a，B）所示。在这两种情况下，预应力跟着随后的加载轮回朝向新的设定点而减小，但跟着加载频率的增多而减小的进程更大（c）。固然当沉稳施加回荡时平均张力保合手升高，但跟着非凡的轮回，平均张力在0.25 Hz（d）下朝向静息张力裁汰。在滋长张力条目下，当回荡频率快于规复时候常数（1/fτ）时，这些行径导致渐进性延长反应（e）。然则，当回荡频率慢于规复时候常数（1/fτ）时，不存在这种延长响应。

在本节中，咱们照旧标明，与2D培养中的细胞一样，3D微组织培养物应变软化以稳态保管其平均张力。肌动卵白丝7、9、10、11通过切丝卵白13的堵截才能解聚和肌球卵白马达团结14、15、43、44、45的扰动是先前假定的2D培养中细胞中这种反应的机制。另一方面，微管的参与在很猛进程上被残酷，尽管它们对通盘细胞力学46，47，48，49和它们的动态不踏实性50的孝顺。因此，咱们讨论了肌动卵白，肌球卵白和微管对微组织应变软化的孝顺。 咱们脱手讨论肌动卵白微丝的参与。

Dynamic stretch remodels and depolymerizes actin动态拉伸重塑妥协聚肌动卵白

为了评估肌动卵白细胞骨架在应变软化中的作用，用细胞松懈素D（CytoD）解聚f-肌动卵白。如所预期的，CytoD处理裁汰了静息张力、僵硬度和相位滞后（图4a和S12）。紧迫的是，CytoD处理还缓和了软化反应（N = 16次重复测量t试验，p < 0.001）（图4 b）。事实上，CytoD处理的微组织的刚度与应变幅度无关（重复测量t试验，P > 0.05）。拉伸住手后，CytoD处理也遏止了张力规复;进一步阐发CytoD处理的微组织不会软化（图4c）。这些效果标明，应变软化是依赖于一个密集团员的肌动卵白细胞骨架的变化。

软化需要齐备的肌动卵白细胞骨架。CytoD解救前后的微组织图像见图（a）。如红色虚线和黄色虚线椭圆所示，它们描画了力传感悬臂的顶部（左），F-肌动卵白与细胞松懈素D（CytoD）的解聚作用显著地使悬臂向外移动，标明静息张力较低。紧迫的是，CytoD处理裁汰了大幅度拉伸与小幅度拉伸下的刚度变化（即，应变软化量）（B）。在牵张住手后也莫得张力规复（c）。（a）中的比例尺示意100 μm。

上述效果标明，f-肌动卵白是微组织应变软化所必需的。为了进一步将软化反应与细胞骨架的变化规划起来，咱们用活细胞染色剂标志了肌动卵白丝。然后，通过比较不同合手续时候的静态休息或回荡拉伸之前和之后拍摄的图像，咱们评估了拉伸是否增多了肌动卵白重塑的速度。规划总计热图泄露了微组织中心区域内的肌动卵白重塑（规划总计低的区域示意高重塑），如图5a所示。肌动卵白重塑是空间异质性的通盘微组织，并跟着时候的推移，静态和负载条目下增多。紧迫的是，与静态条目比较，回荡负荷在1分钟和5分钟后显赫增多肌动卵白丝的重塑（裁汰平均规划总计）（N = 6，重复测量t试验，P < 0. 05）。05)（图5b）。

回荡拉伸增多3D培养中活细胞中肌动卵白丝的重塑。通度日细胞染色和比较不同合手续时候拉伸或静态培养前后即刻汇集的共聚焦堆栈，在活微组织的中心区域（212 × 106 µm;红色矩形）测量回荡拉伸对肌动卵白重塑速度的影响（a）。彼此关总计的代表性热图泄露肌动卵白重塑在空间上是不均匀的，而况跟着大幅度拉伸而增多，相对于静态条目（B）。平均规划总计显赫裁汰（即。在1分钟和5分钟后（B），当拉伸相对于静态时，发生了更精深的重塑）。（B）中的比例尺示意50 μm。（*P < 0.05; N = 6重复测量t试验）。

为了讨论重塑是否只是由组织变化或细丝解聚引起，在9%应变下拉伸不同合手续时候后立即固定微组织并染色。代表性图像、平均热图和每个细胞的平均f-肌动卵白抒发（鉴识为图6a-c）都标明f-肌动卵白在回荡拉伸下快速解聚（N > 14）。然则，这种响应的进程（25%减少）显著小于先前在2D培养物中的分离细胞中的报说念（约50%减少），其在可比较的合座应变幅度下12、13，这可能是因为由更软的ECM40内的细胞旋转引起的应变屏蔽。

F-肌动卵白跟着拉伸解聚，并在拉伸住手时从头团员。不同拉伸合手续时候后的代表性图像泄露，拉伸合手续时候越长，肌动卵白丝越少（a）。平均热图中的F-肌动卵白抒发跟着拉伸合手续时候肖似地裁汰（B）（N > 14）。此外，f-肌动卵白抒发在牵张住手后规复到启动值（N > 11）。在不同的拉伸和规复合手续时候下，归一化为细胞数目的平均肌动卵白抒发鉴识泄露在（c，d）中。（a，B）中的比例尺鉴识代表50和100 μm。

然后，为了泄露f-肌动卵白在拉伸住手后从头团员，将微组织固定并在拉伸5分钟后的不同规复时候后染色。平均热图和每个细胞的f-肌动卵白抒发（图6 b、d）泄露完全规复到启动抒发值（t试验P > 0.05）（N > 11）。固然咱们的f-肌动卵白抒发的时候分辨率很差，不细目性很大，但f-肌动卵白规复的速度似乎与张力和刚度规复的速度在吞并数目级（数十秒）内，这标明机械测量反应了肌动卵白的再团员。此外，3D微组织中肌动卵白的回收率与先前在分离细胞12、13和精深3D培养物31中的报说念格外。

Myosin and microtubules do not contribute to strain softening肌球卵白和微管对应变软化莫得孝顺

咱们照旧细目肌动卵白丝在3D微组织的应变软化响应中起主要作用，然则，细胞46、47、48、49、51和微组织的机械行径也高度依赖于肌球卵白活性和微管（图7a和S12）。因此，为了评估肌球卵白和微管对应变软化的孝顺，咱们查验了用blebbistatin（Bleb）扼制肌球卵白和用nocodazole（Noco）解聚微管后的反应。

微管和肌球卵白不有助于软化。诺考达唑和blebbistatin解救前后的微组织见（a）。微管解聚与诺考达唑移能源传感悬臂向内，标明增多预应力。违背，用blebbistatin扼制肌球卵白II使悬臂向外移动，标明预应力裁汰。两种处理都莫得编削应变软化量的百分比变化（B）。此外，微管解聚增多了张力规复，而肌球卵白扼制裁汰规复（c），但两种解救都莫得编削规复反应的时候常数。（a）中的比例尺示意100 μm。

用blebbistatin扼制肌球卵白可裁汰微组织硬度（N = 10，重复测量t试验，彩乐园官网（中国）有限责任公司P< 0.05）和预应力（p< 0.01）（SI 2）。然则，肌球卵白扼制不影响应变软化（N = 10，重复测量t试验，P % 3 E 0.05）。正如预期的那样，它如实裁汰了张力规复的进程（图7c），因为预应力的裁汰并不令东说念主骇怪地伴跟着肌球卵白扼制。然则，由于规复率莫得变化，肌球卵白轮回不太可能是软化后规复的原因（SI 1）。尽管有可能对肌球卵白马达存在不完全扼制，但根据blebbistattin测量的剂量反应弧线（SI 3），这种情况不太可能发生。此外，即使在不完全扼制的情况下，如果肌球卵白团结的干扰是微组织的应变软化反应的原因，那么东说念主们仍然不错预期软化反应会减少。

至于微管，与它们主淌若反抗肌动卵白活性的压缩元件46、47、48、49的假定保合手一致，微管解聚增多了微组织硬度（N = 15，重复测量t试验，P < 0.001）和预应力（P < 0.001）（SI 2）。然则，就储存刚度的百分比变化而言，微管解聚对应变软化莫得影响（P > 0.05）（图7b）。正如预期的那样，它如实增多了统统张力规复（图7c），因为奉陪微管解聚的预应力增多。然则，同样，软化的分子机制不太可能受到微管解聚的影响，因为回收率莫得变化（S11）。 情理的是，回荡拉伸如实增多了微管的重塑，在拉伸一分钟和五分钟后与静态条目有显赫互异（S14）（N = 7，重复测量t试验，鉴识为p < 0.01和p < 0.05）。然则，拉伸莫得编削每个细胞的微管团员度（SI 4）（N > 14，单成分方差分析）。

Strain softening is a conserved response for microtissues应变软化是微组织的保守反应

咱们照旧标明，微组织构成的3T3成纤维细胞，效法结缔组织，应变软化通过肌动卵白解聚。为了评估这种行径是成纤维细胞独到的照旧其他细胞类型共有的，咱们评估了由东说念主气说念平滑肌细胞（HASM）和骨骼肌细胞（C2C12）构成的微组织中的应变软化反应。在这方面，平滑肌和骨骼肌微组织应变软化（线性转头：鉴识为R2= 0.99、0.98 P < 0.001、0.001）（图8a）。咱们还发现，骨骼肌微组织的相位滞后随应变而减小（线性转头：R2=0.99，P < 0.001），而在平滑肌微组织中莫得统计学显赫趋势（R2=0.43，P = 0.14）（图8b）。 此外，与成纤维细胞微组织肖似，HASM和C2C12微组织分享对其预应力的应变依赖性裁汰（线性转头：鉴识为R2= 0.98、0.94 P < 0.001、0.01）（图8c）。紧迫的是，再次对于统统细胞类型，这些响应导致不变的平均应力（线性转头：P > 0.05）（图8d），尽管它们的平均长度变化很大（线性转头：R2=0.99，P < 0.001，数据未泄露），并导致微组织延长（即，L0随应变幅度增多而增多）（线性转头：线性转头：均R2=0.95，P < 0.01）（图8e）。

应变软化是微组织培养中的保守反应。由成纤维细胞（3T3）、东说念主气说念平滑肌（HASM）或骨骼肌（C2 C12）细胞构成的微组织均发生应变软化，其刚度（a）、相位滞后（B）和预应力（c）发生肖似变化。对于统统细胞类型，平均张力随拉伸幅度（d）不变，尽管它们的平均长度线性增多（数据未泄露）。这些行径共同导致偏移微组织长度（e）增多。3T3、HASM和C2C12微组织在拉伸住手后的储存刚度（f）和预应力（g）规复速度方面也具有相似的规复能源学。

在裁汰应变幅度后，HASM和C2C12微组织的刚度和张力规复，如先前用成纤维细胞培养物不雅察到的（图8f，g）。偏移的微组织长度也规复了（数据未泄露）。HASM细胞中刚度规复的时候常数在统计学上大于3T3或C2C12微组织（单成分方差分析，P < 0.05）（S11）。张力规复的时候常数两两比较吻合（单成分方差分析，P > 0.05）。

Discussion 询查

在这篇著作中，咱们的主张是评估在机械和生物学上重现细胞在体内所资格的3D环境的条目下滋长的细胞对急性回荡拉伸的反应。为了好意思满这一方针，咱们开导了一种新的门径，允许高通量测量的动态力学性能和平直可视化的细胞骨架在3D微组织细胞培养。咱们的门径包括一系列真空驱动的致动器来拉伸微组织和光学追踪力传感器来测量它们的机械行径。咱们的门径的优点和局限性总结在SI 5中。在使用咱们的门径，咱们标明，微组织软化动态拉伸的相貌肌动卵白解聚。此外，通过这种软化行径，微组织稳态地保合手其平均张力，并导致拉伸疏导的组织延长。 在这篇著作的其余部分，咱们进一步询查这些发现中领路出的微组织，最初琢磨若何拉伸影响其力学，然后其次，这种反应的机制基础，通过拉伸疏导的细胞骨架重塑。

Microtissues soften under dynamic loading微组织在动态载荷下软化

咱们发现，由三种不同类型的细胞构成的活的三维微组织培养物的预应力和储能模量跟着动态应变幅度而裁汰。这一发现与先前在2D培养7、42、52和离体组织条14、15中的细胞中的报说念一致。此外，它可能反应了一种紧迫的机制，通过这种机制，组织保合手其长度，从而保合手通盘躯壳的稳态。举例，应变软化不错解释来自深吸气的大的潮气伸展若何好像大开健康肺14、15中的收缩气说念而况好像有助于动脉17中的血压调遣。

突出是对于ASM组织条，动态拉伸照旧泄清晰当有主张地围绕平均长度14回荡时引起软化，而况当有主张地围绕平均张力15回荡时引起伸长。同样地，当ASM组织条在滋长张条目下回荡以模拟气说念壁和实质地理力的被能源学时，照旧报说念了显赫的延长和软化19。固然咱们的讨论效果支合手组织条软化和延长的这些陈述，但咱们承认气说念壁中可能存在几何和结构互异，这些互异会缓和齐备气说念中的这些反应16。 此外，固然当年的职责依赖于一个复杂的筹备模子来限制伺服电机提供一个生感性的滋长负荷条目19，咱们的门径张力和长度耦合通过力传感悬臂的迤逦刚度。然则，也许更紧迫的是，哮喘肺66中的张力增强系留力的亏空不错解释为什么莫得发生来自深吸气的正常延伸响应18。固然咫尺尚不明晰悬臂的弹簧常数与肺实质地理力的真正关系，但通过浅易地编削悬臂刚度，不错在MVAS力的进一步发展中拿获哮喘中不雅察到的变化。 尽管如斯，咱们并不以为咱们咫尺盘算中的力和长度的耦合会影响应变软化和伸长的不雅察趋势，也不以为咱们不雅察到的微组织妥当动态拉伸以保合手其平均张力。

除了软化和延长以外，恒久以来一直有报说念称，2D培养中的离体组织条和细胞在拉伸时领路出更像流体的行径14，15，67，68，69。最近，细胞的这种流化反应与一类称为软玻璃（举例玻璃）的惰性材料的流化反应规划。泡沫、紧密乳液、糊状物和浆料）7。然则，与这些报说念和软玻璃流变学假说违背，骨骼肌和成纤维细胞微组织实践上跟着更大的应变幅度而变得更像弹性，平滑肌微组织莫得显著的相变。因此，微组织与2D培养中的离体组织条和细胞比较，其行径不同，或者在咱们的测量中存在期间伪影。 话虽如斯，咱们不以为原因是后者，因为弹性规范的测量给出了如预期的简略为零的相位滞后（S16），而况咱们的测量与肖似的3D细胞培养物中的先前报说念很好地一致34。一个更可能的原因，也可能是这项职责的局限性，是咱们在培养微组织时使用的胶原ECM与齐备组织的构成不同，进而与齐备组织的机械行径不同。举例，卵白聚糖限制水的质量运输，因此是能量耗散的重要决定成分，咱们莫得将其纳入咱们的微组织中。此外，在这方面，在去除大部分细胞组分后，用CytoD处理，主要描摹基质孝顺的剩余机械行径是弹性的，对能量耗散孝顺很小（S12）。 因此，当细胞软化（而况可能流化）时，可能照旧感知到更肖似弹性的行径，因为与弹性基质比较，细胞对合座机械行径的孝顺变得不那么显赫。其他可能的解释包括在应力-应变弧线上评估力学的位置互异，以及由体内合手续机械调遣引起的微组织和离体样品之间的结构互异。尽管如斯，在畴昔的职责中，仍然有敬爱评估微组织是否撤职一样的时候规范不变性71，该时候规范不变性71照旧牵引了细胞的机械行径撤职Sollich（1997）对于软玻璃流变学的表面72的假定。

应变住手后，咱们发现，微组织刚度规复到干豫前的值沿着保存难懂的轨迹，不错在三个量级的时候与拉伸指数建模。拉伸指数先前已被用于描摹无序系统73、74中的弛豫进程，而况不错从具有弛豫时候的非粗犷漫步75的浅易指数函数的线性叠加出现。因此，从细胞骨架的复杂性质和琢磨细胞聚拢体时产生的非凡复杂性来看，这种功能可能出现并不令东说念主过分骇怪。尽管如斯，咱们发现，对于统统泄露规复响应和细胞类型的测试处理，预应力和刚度的规复时候常数在35和43秒之间（除了HASM微组织中的刚度规复）。 这个时候常数似乎是在一样的数目级，如先前报说念的规复皮质肌动卵白刚度后，在二维培养细胞顷然拉伸7。倒霉的是，这项职责的作家莫得将他们的弧线拟合到拉伸的指数。然则，他们承认，规复发生的时候规范跟着拉伸住手后的时候而增长，而况比指数进程慢，这是拉伸指数的特征。

咱们以为，上述这些反应与先前在3D细胞培养物中报说念的响应于准静态负载的张力稳态行径规划29，30。在这方面，已知细胞将编削其里面收缩性以反抗外部机械负荷以保管设定点张力。为了与这一主张保合手一致，咱们发现妥当难懂的微组织的预应力和刚度的裁汰足以在越来越大的应变幅度和越来越大的平均长度下保合手恒定的平均张力。因此，也许最紧迫的是，咱们的职责扩展张力稳态的条目下，动态施加负载。 此外，咱们发现，妥当性反应发生在生理负荷率，但手脚一个不错预期的生物体好像栽种，它是不存在时，负荷施加慢于张力和刚度规复时候常数。

在文件中，应变软化存在于一个悖论中，精深的讨论陈述了应变硬化和肌动卵白增强对拉伸的反应53。在合手续拉伸或沿应力-应变弧线查验沿着不同位置时，重构的交联肌动卵白凝胶54、55、细胞56和3D细胞培养物34、57都泄清晰应变。这种非线性效应由肌动卵白丝54、55的重组引起，而况对于组织，由细胞的从头定向和这些局部效应穿过细胞培养物57的浸透引起。固然咱们的加载回路大部分是线性的，但在大应变幅下不错在一定进程上不雅察到力-应变回路中通过非线性的应变硬化（来自非线性的总谐波失真从0.041 ± 0.002至9%应变下的0.152 ± 0.004（P < 0.0001，重复测量t试验））。然则，这种影响小于动态加载产生的软化行径。另一方面，照旧报说念了下流信号级联通过肌动卵白微丝增强52、58、59、60、61、62手脚一种负反馈引起机械硬化，以保管局部机械应力63、64。在这方面，微组织先前照旧泄清晰在动态拉伸15分钟后发生变形38、65。咱们还报说念了在慢性（2天）条目下微组织中的肌动卵白强化40。 紧迫的是，在这些拜谒中，准静态刚度测量和f-肌动卵白抒发进行了评估后，负载和一段时候后大于刚度规复和肌动卵白再团员的时候规范，咱们在这里报说念。也即是说，在咱们相对较短的实验窗口内，咱们莫得不雅察到启动和完全规复的刚度、预应力、长度和f-肌动卵白抒发测量之间的任何互异。

Stretch depolymerizes actin in microtissues拉伸解聚微组织中的肌动卵白

固然细胞和组织的应变软化已被平素报说念7，14，15，42，52，这种反应背后的分子机制仍不明晰。在这里，咱们拜谒的孝顺肌动卵白微丝，肌球卵白II电机和微管。这篇著作的其余部分是一个询查，涵盖了这些细胞骨架元素中的每一个在动态载荷下的细胞和组织的力学行径的孝顺。

最初，在细胞中，肌动卵白细胞骨架是一种丝状汇集，它赋予细胞局势并违反张力。在2D培养中，照旧报说念了细胞的拉伸使肌动卵白丝脱髓鞘9，10，11。咱们在3D培养微组织中的效果倾向于与这些不雅察效果一致。简而言之，咱们发现1）f-肌动卵白是应变软化和规复反应所必需的; 2）活细胞中的肌动卵白重塑随拉伸而增多; 3）短期拉伸裁汰f-肌动卵白抒发; 4）拉伸住手后，f-肌动卵白抒发沿着规复，与张力和刚度规复一样。这些讨论效果锐利标明，应变软化，至少部分，来自肌动卵白解聚。 咱们不雅察到的周期性拉伸住手后肌动卵白再团员的时候规范也与先前报说念的3D细胞培养物中步长变化31和分离细胞中顷然拉伸12，13后的测量效果一致。

固然肌动卵白的调遣波及多种卵白质，并莫得完全意会，应变疏导的肌动卵白解聚最近已被说合到增多cofilin活性。在这方面，在2D培养中敲低细胞中的这种肌动卵白堵截分子，减少软化，而况它们的肌动卵白丝在顷然拉伸后基本上保合手齐备13。此外，肌球卵白Ib最近被阐发不错手脚一种拿获团结的肌动卵白解聚酶（其对肌动卵白的亲和力，因此其应力纤维堵截才能，跟着施加的载荷而锐利增多）76，因此也不错促进细胞和组织的应变软化行径。另一方面，肌动卵白的规复反应可能部分介导的zyxin促进应力纤维栽种。 在这方面，先前照旧标明，zyxin定位于应力纤维断裂的位点，而况zyxin的敲低裁汰了单细胞中收缩力的规复，并导致拉伸12后精真正割的肺切片中更快速的延伸。在咱们的MVAS力装配中评估这些卵白质可能会进一步了解它们对细胞骨架和组织力学特色的动态调遣的孝顺，因此，应该是畴昔讨论的重心。

接下来对于肌球卵白II马达，它们通过交联和主动拉动肌动卵白丝产生张力来调遣细胞的机械行径。重建肌动卵白-肌球卵白采荟萃的应变软化归因于肌球卵白交联的阻扰43，44，45。在气说念组织条14、15中的软化反应中也波及到肌球卵白团结的扰动。然则，与这些报说念违背，咱们发现微组织的软化对肌球卵白活性是不变的，而况应变住手后的规复反应速度莫得变化。这锐利标明，肌球卵白在3D培养中细胞的软化反应中莫得作用。

终末，对于微管，尽管咱们对它们在细胞力学中的作用的意会仍在不断完善77，但东说念主们以为它们充任了反抗肌动卵白-肌球卵白收缩性的压缩扶持，如张拉合座结构46，47，48，49。因此，与其他几项在2D中测量细胞牵引力和刚度的讨论一致46，78，咱们发现用诺考达唑解聚微管增多了微组织刚度和预应力（S12）。相对较少的讨论评估了拉伸细胞和组织若何影响微管重塑和团员。也即是说，当细胞变形时，不错看到微管迤逦48，而况在2D培养中滋长的轴突中，微管照旧被阐发在大的（75%）动态载荷下解析79。 违背，咱们莫得不雅察到微管团员的任何变化，诺考达唑处理对软化反应莫得影响。然则，动态拉伸如实增多了微管重塑。拉伸是否平直导致微管的重排，或者它们只是根据肌动卵白解聚而重塑，以及所不雅察到的微管重塑是否有助于细胞力学行径的变化，是畴昔讨论的情理问题。

Conclusions 论断

在本文中，咱们建议了一种新的高通量门径，用于评估动态细胞力学并可视化亚细胞水平的重塑，以响应生理规划3D微组织培养物中的拉伸。咱们的门径提供了将2D培养中不雅察到的行径与软3D基质中的细胞（与东说念主体组织格外）规划起来的才能，并将细胞骨架的视觉重塑与机械性能的变化规划起来。在这方面，咱们发现，成纤维细胞，平滑肌和骨骼微组织培养物都有一个保守的软化反当令，动态拉伸和规复后的拉伸住手。微组织的反应，以保合手其平均应力，并在滋长素的条目下，他们的反应导致延长。此外，通过平直定量细胞骨架重塑，这些行径似乎是由快速肌动卵白解聚引起的。 这标明肌动卵白微丝是细胞中机械拉伸的传感器，而况反过来，酿成反馈回路以限制组织的机械张力。细胞感受和反应来自其环境的机械刺激的才能是保管体内稳态的紧迫机制，因此，对咱们门径的进一步琢磨可能会揭示充分意会很多病感性疾病的重要方面。

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